Int J Hematol. 2019 Aug;110(2):161-169. 

Clinical update on hypomethylating agents

Matthieu Duchmann1,2 • Raphael Itzykson1,3

去甲基化药物的临床进展

摘要:

去甲基化药物（HMAs）阿扎胞苷和地西他滨是高危骨髓增生异常综合征（MDS）和不适合强化治疗的急性髓系白血病（AML）患者的标准治疗选择。在过去的10年里，对于HMAs分子和细胞水平上的作用机制和识别其有效性的生物学标志进行了大量研究。目前HMAs在髓系肿瘤中的临床疗效已基本确定，但其疗效有限。除HMAs在髓系肿瘤疾病不同阶段使用的优化外，大部HMAs临床进展将来自第二代HMAs（口服型和/或改进了药代动力学），和目前以经验性研究为主的HMAs联合用药物研究。

介绍

阿扎胞苷(5-氮杂胞苷，AZA)和地西他滨(5-氮杂-2’-脱氧胞苷，DAC)是胞嘧啶核苷的两个类似物，其在低临床相关浓度可抑制DNA甲基转移酶 (DNMTs), 引起短暂、可变的DNA 去甲基化，被称为“去甲基化药物” (HMAs) 。HMAs在髓系肿瘤,包括骨髓增生异常综合征(MDS)，慢性粒单核细胞白血病 (CMML) 和急性髓系白血病 (AML)表现出治疗活性。然而，疗效异质性大，且很少持续。这篇评论提供了关于HMAs在髓系肿瘤临床应用中的更新。同时也对HMAs临床进展，包括新一代HMAs和 HMAs为基础的联合方案的有效性做一综述。

一、HMA的作用机理

近期HMAs的代谢过程被详细的回顾[1]如图1所示。HMAs 被吸收后，由于自发水解和被胞嘧啶核苷脱氨酶(CDA)去氨基化极在血浆中不稳定，这解释了HMAs血浆半衰期短 [2]。HMAs由核苷酸转移酶转运至细胞内后，继而被细胞内激酶磷酸化；地西他滨（DAC）转化为有活性的三磷酸代谢物(5-aza-dCTP)在细胞周期中直接整合于DNA。对于阿扎胞苷（AZA），5-aza-CTP多数与RNA结合，少部分由核糖核苷酸还原酶转化为5-aza-dCTP 在DNA复制过程中整合与DNA。5-aza-dCTP整合于DNA并与DNMT1结合，使DNMT1降解；在几轮DNA复制后使DNA发生渐进的去甲基化，使被抑制的抑癌基因再激活[3]，诱导肿瘤细胞衰老和凋亡。HMAs还可以促进肿瘤相关抗原表达，诱发机体抗肿瘤免疫反应[4]。在实体瘤中，HMAs促进内源性逆转录病毒成分表达，诱导干扰素依赖细胞杀伤[6,7]。在髓系肿瘤中是否存在类似的现象有待进一步研究。

阿扎胞苷在具有TET2突变的AML小鼠模型中显示了促进白血病分化的作用[8]。尽管目前认为HMAs的临床疗效主要来源于去甲基化作用而不是细胞毒作用；但除了去甲基作用外5-aza-dCTP结合于DNA可诱导DNA损伤[9]。此外，5-aza-CTP结合于RNA可干扰蛋白质合成[10]，从而也促进细胞凋亡。一种新的质谱分析方法可量化AZA分别整合与RNA, DNA和在细胞浆中的分布。这个方法显示似乎AZA整合于DNA而不是RNA是反应速率的限制步骤。

二、HMA已批准在血液肿瘤中的使用

1.骨髓增生异常综合征

自AZA-001研究以来，AZA一直是高危MDS和不适合异体干细胞移植(ASCT)AML患者的标准治疗。随机的III期临床试验证明阿扎胞苷治疗优于最佳支持治疗、小剂量阿糖胞苷或者强化化疗；提高了低危MDS和老年低白血病细胞比例AML患者的整体存活率，并延迟AML转化[12]。地西他滨在高危MDS患者中也显示了治疗活性，但没有转化患者生存率的提高，当然这可能是由于试验设计的原因[13]。HMAs也被尝试作为低危MDS的一线治疗[14,15]。但是，阿扎胞苷对促红细胞生成素无反应的患者的疗效非常有限。在美国AZA和DAC都被批注用于MDS治疗，但在欧洲只有AZA被批准用于int2/高危MDS治疗。

2.慢性髓细胞性白血病

小样本的非随机前瞻性临床试验报道AZA[17]和DAC[18]对于CMML具有治疗活性。因为传统化疗对于CMML-2的疗效有限，以及AZA-001试验包括一些CMML-2患者，AZA在欧洲批准用于CMML-2治疗，但DAC未在欧洲获得批准。而在美国两种药物都被FDA批准用于CMML治疗。一项比较DAC±羟基脲与羟基脲单药对于增殖性CMML疗效性的前瞻性随机III期临床研究正在进行(NCT02214407)。

3.急性髓系白血病

AZA-001试验的亚组分析重点在于低原始细胞计数（原始细胞20-30%）的AML[19]，在另一项对于骨髓中原始细胞>30%的老年AML的大样本III期随机临床研究中，AZA与传统治疗相比提高了不适合进行强化疗患者的生存率[20]。且在存在不良细胞遗传学或骨髓异常增生改变的高危AML患者中生存率的改善更为明显[21]。DAC在老年中高危AML患者中也表现出疗效，但与最好的支持治疗或低剂量阿糖胞苷（AraC）相比未显示能提高患者生存率[22]。在美国AZA和DAC均被批准用于低原始细胞（原始细胞20-30%）AML的治疗；而在欧洲，两者被批准用于所有不适合移植的AML治疗，无论原始细胞比值。

三、预测HMAs反应的生物标志物

HMAs单药仅一小部分患者获得治疗反应，且反应很少持续，与患者生存的改善也仅存在有限相关性[12,18,20]。累计证据表明，HMAs的作用主要针对二级克隆突变[23-25]，而始动克隆得以幸免，并通过在获得额外的突变导致疾病复发[23-27]。因此，迫切需要能够预测HMAs治疗反应和带来生存获益的可靠的生物标志物。由于涉及甲基化的基因突变是髓系肿瘤的常见突变，它们对于HMAs治疗反应的影响已被广泛研究。HMAs对于存在TET2突变的MDS[28-32]或CMML治疗反应可能性更高 [32]，尤其是在不伴ASXL1突变的情况下。其他涉及甲基化调节因子DNMT3A的突变[30,31,33]和IDH1/2[31,34]也可能预测其对于AML和MDS的反应性。对于典型预后不良的TP53突变，是否可通过DAC强化治疗予以清除仍有争议[18,35 - 38]；目前认为TP53突变状态与HMAs治疗反应的缺乏相关性，这可能与多种突变间的相互影响和肿瘤的异质性相关。临床上AZA治疗MDS和AML过程中，白血病祖细胞中合并较少继发性克隆突变的患者，对于HMAs治疗响应率更高[23]。

启动子基线甲基化水平和治疗反应之间无相关性[39,40]，可能是由于瘤肿瘤表观遗传异质性[41]。在CMML中研发的一个表观遗传学分类器的检测方法（包括末端增强子的分析）可能预测DAC的治疗反应[42,43]。未来的研究将确定活跃的增强子对于DAC的反应性的预测作用。随着甲基化组蛋白检测技术的进展，检测将更为便利[44]。核染色质组也可能影响HMAs疗效 [45]。的确，RNA:m5C甲基转移酶NSUN1结合BRD4和RNA聚合酶II可形成活性染色质结构，其对AZA不敏感。在对AZA耐药的MDS和AML样本中存在NSUN1/BRD4显著提高，其可导致活性染色质形成，解释了ZAZ耐药的原因。5-Aza-dCTP需要在细胞周期中整合于DNA；最近的数据提示AZA耐药与有效的患者相比，在治疗开始时存在更多静息的白血病祖细胞[23,25]。

最后，药物基因组学可以部分解释HMAs反应的异质性。有报道体细胞突变和/或编码HMAs摄取（hENT1基因[46, 47]）和代谢（UCK和DCK激酶[47-49]）基因的异常表达与MDS和AML耐药有关。提高可促进HMA降解的CDA活性也与HMAs耐药有关。影响CDA活性的基因多态性可以预测患者对其他胞嘧啶类似物的反应[50,51]。

四、HMAs的新方案

1.强化治疗

在AML和MDS中HMAs的强化治疗可提高疗效。10天的DAC治疗在高危细胞遗传学和TP53突变的MDS和AML患者显示出高反应率[35]。最近的一项研究显示AZA强化计划(75 mg/m2，d1-5，每14天)在高危MDS中也可提高响应率[52]。因此，HMAs强化疗法可以增加有效性，但可能以增加毒性为代价，这使需要进一步的随机比较研究证明方案的可行性。

2.维持治疗

HMAs对于复发或难治性髓系肿瘤，包括强化后或ASCT后的患者中具有治疗活性[53]。因为HMAs有增强抗肿瘤免疫的作用，CR患者给予HMAs维持治疗可能预防疾病复发。初步研究表明移植后患者给予HMAs维持治疗的可行性，尽管因为药物毒性需下调导致HMAs剂量[53]。一项评估AZA(32 mg/m2, day 1-5) 与安慰剂对比的用于MDS和AML患者ASCT后维持治疗作用的III随机试验(NCT00887068)正在进行。AZA口服制剂CC-486在AML和MDS患者 ASCT后维持治疗中显示有良好的耐受性[54]，且便于剂量调整和坚持治疗。目前CC-486正被评估作为未经治疗AML患者强化疗后的维持治疗(QUAZAR AML-001, NCT01757535)，和AML和MDS患者ASCT后的维持治疗(NCT01835587)手段。

经过几次失败或动力不足的试验后[55-57]， HOVON（丹麦-比利时血液肿瘤合作组）进行了一项高风险的试验。>60岁的MDS或AML患者在2个疗程的强化疗获得CR/CRi后，被随机分配到减低剂量AZA组 (50 mg/m2，第1-5天)或观察组。这个研究第一次提供了AZA维持治疗可延长无病生存(DFS)期的数据。虽然可能因研究中患者数量有限(n = 116)，DFS并没有转化成总生存（OS）获益，但其为表观遗传治疗作为老年AML维持治疗提供概念性证据[58]。

3.抢先治疗

另一个预防复发的策略是一旦疾病有早期复发迹象，如微小残留病(MRD)增加，即开始治疗。在RELAZA-2 II期试验中研究者对经强化疗或化疗后达到CR，但MRD（+）AML和MDS患者开始AZA治疗[59]。尽管缺乏随机对照组，抢先治疗患者与历史对照相比可能延缓了MRD+患者的复发，特别是MRD低水平患者。当然，这些结果有待于进一步的随机试验证实。

4.治疗髓系肿瘤相关的炎症表现

多达30%的MDS/CMML患者中存在系统性自身免疫性和炎性疾病(SAID)。HMAs可以

控制这些临床表现，包括类固醇依赖或耐药的SAID。在大多数情况下HMAs对髓系肿瘤和SAID的作用表现出一致性[60]，这表明其作用主要是通过逆转肿瘤的旁分泌作用实现的，而并非直接作用于免疫系统。目前一项II期研究(NCT02985190)正在进行，以评估AZA在MDS/CMML患者中对于对激素依赖/耐药SAID疗效。

5.新一代HMAS

口服阿扎胞苷(CC – 486）。CC-486是5-阿扎胞苷的口服剂型，目的是方便给药和剂量调整，最终目的是增加肿瘤细胞对AZA的暴露率[61]。CC-486在AML、CMML和MDS[62]、包括低危MDS [63]中显示治疗活性和安全性。III期的QUAZAR试验(NCT01566695)正在进行，与安慰剂对比评价CC-486在贫血或血小板减少的低危MDS中的治疗作用。CC-486也被研究作为强化疗后(NCT01757535)和ASCT后(NCT01835587)患者的维持治疗。

Guadecitabine是研发的DAC和脱氧鸟苷结合的二核苷酸。它通过拮抗CDA作用提高肿瘤细胞对DAC活性代谢产物的暴露时间 [64]。它皮下注射使用，60毫克/m2*5d。Guadecitabine对于未治疗[65]和复发/难治性[66]MDS和AML具有良好安全性。两项III期试验正在进行，评价Guadecitabine在未经治疗且不宜接受强化化疗AML患者(ASTRAL-1试验，NCT02348489)，和复发/难治性AML (ASTRAL-2 NCT02920008)中的作用。ASTRAL-1研究者已经宣布试验失败，研究中Guadecitabine未能达到两个主要终点，即提高CR率和延长OS，但这次试验的详细科学报告尚未提供。一项比较Guadecitabine和传统治疗相比在接受过HMAs的MDS和CMML患者中作用的III期试验正在进行(NCT02907359)。

Astx727

目前正在研制一种口服DAC制剂。ASTX727是DAC与CDA抑制剂cedazuridine的联合 (E7727)。在MDS和CMML应用的药物代谢动力学分析显示，标准5天静脉DAC和5天口服ASTX727的DAC暴露率近似[67]，治疗耐受性好，有效率是61%。

五、基于HMAs的组合方案

1.联合组蛋白去乙酰酶(HDAC)抑制剂

在髓系肿瘤中，组蛋白尾部去乙酰化可沉默抑癌基因。HDAC抑制剂(HDACi)单药治疗高危MDS和AML有一定活性，体外证据支持HMAs与HDACi之间的协同作用[68]。然而,多次随机试验未能证明HMA与HDACi（包括entinostat[69]、丙戊酸[70,71]、vorinostat[72,73]或pracinostat [74]）联合可带来临床获益，且这种组合可能会造成药物毒性增加。甚至一项研究甚至提出AZA和entinostat间存在拮抗作用，可与是AZA减少了HDACi带来的肿瘤抑制基因的扩增。

2.联合来那度胺

来那度胺在del(5q) MDS中具有治疗活性，其通过降解定位于5q染色体编码的一种靶向蛋白，即酪蛋白激酶1A1（CK1α），诱导合成致死（synthetic lethality）[76]。来那度胺在非del(5q) MDS中也有促进红细胞生成作用[77]。在多项临床研究中，来那度胺和AZA多种经验性联合方案试用于非del(5q)高危MDS、CMML、AML患者，但均未显示临床获益[71,73]。

3.联合sapacitabine

口服阿糖胞苷类似物Sapacitabine单药在AML 中具有治疗活性[78]。然而，大样本随机III期临床研究，比较DAC和DAC+Sapacitabine交替方案与DAC单药用于老年初治AML治疗，联合治疗组未表现出生存优势[79]。

4.联合免疫检查点抑制剂

免疫系统可识别基因突变和表观遗传异常引起的肿瘤相关抗原表达。然而，肿瘤细胞、AML[80]和MDS[81]相关T细胞通过过度表达免疫检查点蛋白引起免疫细胞耗竭，从而逃避机体抗肿瘤免疫。在实体肿瘤中，CLTA-4和PD-1免疫检查点抑制剂有效。目前研究显示，免疫检查点抑制剂在髓系肿瘤中也存在一定的活性[82]。由于HMAs可通过诱导内源性逆转录病毒原件[6,7]，肿瘤相关抗原[4]，以及免疫检查点分子的过表达[81]，增强机体的抗肿瘤免疫；两者的联合具有吸引力。在髓系肿瘤中，几个临床试验评估HMAs与抗PD1单抗 nivolumab (NCT02397720，NCT02397720)，抗PDL1单抗 durvalumab (NCT02775903)，atezolizumab (NCT02508870)和组合nivolumab + anti-CTLA-4 ipilimumab (NCT02397720)方案有效性正在进行。非随机的II期试验评价AZA+nivolumab治疗复发/难治性AML的疗效，显示了中等反应率和可控的免疫相关不良事件[83]。无反应的患者的T细胞存在CTLA-4的高表达。在AML中，

抗CTLA-4单抗ipilimumab联合AZA具有治疗活性[84]。目前一项评估AZA+nivolumab联合或不联合ipilimumab方案在髓系肿瘤中有效性的II期临床试验正在进行(NCT02397720)。

5.联合venetoclax

BCL-2是一种髓系肿瘤常高表达的抗凋亡蛋白，也是白血病干细胞(LSCs)一个潜在的脆弱点[85,86]。Venetoclax（VEN）作为BCL-2的特异性抑制剂，在AML中具有治疗活性；单药在复发AML显示中度疗效[87]。体外实验显示venetoclax和HMAs存在协同作用[88]，为进一步评价联合方案的合理性提供了依据。一项Ib期试验评估联合VEN + HMA用于初治老年人AML，显示了可接受的耐受性；虽然与HMAs单药相比有更明显的骨髓抑制，但获得了高反应率(CR率73%)[89]。虽然研究随访时间尚短，在高危患者中Venetoclax 400mg/d似乎是最佳剂量，具有最好的安全性和较深、持久的反应性。在复发/难治性AML和MDS患者的挽救治疗中，HMAs + VEN联合也显示了疗效[90]。进一步的生物学研究表明，HMAs与VEN组合可独特性改变LSCs的代谢活性，可能解释HMAs与VEN组合治疗的AML患者流式细胞学检查中获得了较高的MRD阴性[86]。因此，未来HMAs和VEN联合有潜力挑战HMAs单药治疗的地位，当然这需要进一步的研究和长期的随访来验证。

6.联合异柠檬酸脱氢酶（IDH）抑制剂

IDH1和IDH2突变在髓系肿瘤中很常见，通过生产2-羟戊二酸盐(2-HG)抑制α-酮戊二酸依赖酶（如TET2等）导致甲基化失调，促进肿瘤进展。IDH2突变的抑制剂(AG-221 [91])和IDH1突变抑制剂ivosidenib (AG-120[92])单药治疗复发/难治性AML显示了疗效。一项1b/2期临床试验(NCT02677922)报道了IDH抑制剂联合AZA在老年初治AML中有效[93]。评估ivosidenib + AZA联合方案有效性的III期临床试验(NCT03173248)正在进行。

7.联合pevonidestat

Pevonedistat (PEV)是NEDD-8激活酶的抑制剂，单药在复发或难治性MDS和AML中具有活性[94]。AML细胞高通量的体外试验显示PEV与HMAs具有协同作用 [95]。一项1b期临床试验在初治不适合强化疗和移植的老年AML，PEV+AZA联合方案总反应率50%，具有可接受的安全性[96]。评估AZA和PEV+AZA在初治MDS、CMML和低原始细胞数的AML中疗效的随机III期临床试验 (NCT03268954)正在进行。

结论

近十多年来，HMAs越来越广泛用于髓系肿瘤的治疗。单细胞表观基因组学的进展提高了我们对HMAs机制的了解；这将最终帮助确定预测HMAs有效性的生物学标准，识别那些患者会从中获益。目前HMAs适应症的范围仍在增加，尤指是作为维持治疗和抢先治疗。第二代HMAs正在评估用于髓系肿瘤。初步结果显示二代HMAs可能会不优于AZA或DAC，但口服剂型至少更为方便，且便于剂量调整和增加用药依从性。联合方案可能最终证明优于单一用药；但是最佳联合方案是通过经验性寻找抑或通过合理的临床前筛选尚未确定。在未来的十数年中，HMAs有潜力成为髓系肿瘤治疗药物中一个重要部分。

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